ELISA .. إليزا

كواشف سلامة الدم باستعمال تقانة ELISA

Blood Safety Reagents Using ELISA Technology

يُعَد التأكد من سلامة الدم المنقول للمرضى أهم ركائز المنظومة الصحية، حيث أنّ سلامة الدم المنقول من الأولويات الهامة لعمل بنك الدم في أي بلد في العالم. ويعتبر مخبر المناعيات العصب الرئيسي لبنك الدم، لذلك وجب الاهتمام به وتجهيزه جيداً، حيث يُعد المكان المتخصص لعمل الفحوص الخاصة بالكشف عن الفيروسات.

وهكذا نجد أنَ الاهتمام بآلية سير العمل والاطلاع على الاجراءات المتّبعة للتأكد من جاهزية العمل وسلامة الفحوص الخاصة بالمتبرعين من أمراض التهاب الكبد والإيدز. 

وحفاظاً على سلامة الدم المنقول للمرضى في بنوك الدم وفي الجهات التابعة لوزارة الصحة، يتم الكشف عن أمراض نقص المناعة المكتسبة (الإيدز) وأمراض التهاب الكبد (B و C) باستخدام تقانة ELISA (المقايسة المناعية الأنزيمية).

وذلك لعدم الحاجة لاستخدام أي مواد مشعة كما ذكرنا في البداية، مما يؤمن الصحة والسلامة المهنية للعاملين في مخابر التحاليل الطبية، وأيضاً للحفاظ على جودة أكياس الدم المنقولة للمرضى.

تحدثنا في مقالة سابقة عن كواشف سلامة الدم باستعمال هذه التقانة الرائدة على مستوى العالم فيما يخص الكشف عن فيروس نقص المناعة المكتسبة AIDS، واليوم سنتناول تطبيقات هذه التقانة فيما يخص فيروس التهاب الكبد B. 

تذكرة بأنواع الإليزا 

تطبيقات الإليزا The Applications of ELISA

لم تصبح تقانة ELISA شائعةً بعد في المخابر البكتيرية Bacteriological Laboratories، لكنها تعتبر التقانة الرائدة في المجال الفيروسي، ومن المرجح أنها ستستمر في احتلال المكانة الرائدة في تشخيص الإصابات الفيروسية، مثل:

- فيروس الإيدز HIV (نقص المناعة المكتسبة). 

- فيروس التهاب الكبد بنوعيه B و C. 

التهاب الكبد B والأمصال الفيروسية Viral Serology & Hepatitis B

المستضد السطحي لفيروس التهاب الكبد B (HBsAg) Hepatitis B Surface Antigen (HBsAg)

يعتبر HBsAg أول واسم مصلي تم تحديده في عدوى الالتهاب الكبدي الوبائي الحاد B Hepatitis B infection، عادة ما يظهر هذا الواسم من 2 إلى 6 أسابيع قُبيل ظهور الأعراض (تظهر من 1 إلى 10 أسابيع بعد حدوث العدوى). يمكن كشف HBsAg مصلياً قبل أي ارتفاع في مستويات إنزيم الترانس أميناز، حيث يختفي من المصل بعد بضعة أسابيع إلى بضعة أشهر بعد اكتشافه في البداية. و لا يمكن كشف HBsAg وقت حدوث العدوى في حوالي 10 ٪ من المرضى. في هؤلاء المرضى، قد يفوت الطبيب تشخيص التهاب الكبد الفيروسي الحاد Acute Hepatitis B Viral Infection إذا لم يتم إجراء اختبار IgM للمستضد اللبي لفيروس التهاب الكبد B HBC . 

ومع ذلك، من المهم أن يدرك الطبيب أن التهاب الكبد الحاد المصاحب لوجود المستضد HBsAg ليس مرادفاً للإصابة بالتهاب الكبد B الحاد. وهناك العديد من الحالات التي يمكن أن تسبب إصابات كبديّة حادة عند المريض المصاب بالتهاب الكبد الفيروسي المزمن، وبالتالي تحاكي العدوى الفيروسية B الالتهابية الفيروسية. وإعادة تنشيط فيروس التهاب الكبد B، والإصابة بفيروسات الكبد الأخرى (A ، C ، D ، E ، CMV ، EBV)، الانتانات البكتيرية المسببة لالتهاب الكبد الحاد (داء الريكتسيا rickettsia، داء البريميات leptospirosis) الانسمام الكحولي وتعاطي المخدرات والإسكيميا (أي فقر الدم الموضعي) وإفقار الكبد. 

يستمر وجود المستضد HBsAg عند بعض المرضى، ويشير استمرار وجود هذا المستضد بعد 6 أشهر إلى حدوث عدوى فيروسية مزمنة من التهاب الكبد B. 

المستضد E لالتهاب الكبد B (HBeAg) Hepatitis E Antigen (HBeAg)

في حالة الإصابة بالتهاب الكبد الفيروسي B الحاد Acute Hepatitis B Viral Infection، يظهر المستضد HBeAg عادة في المصل بعد فترة وجيزة من اكتشاف المستضد HBsAg. هذا المستضد هو مقياس للتكاثر الفيروسي الفعال active viral replication. 

يترافق وجود HBeAg عادة مع مستويات عالية من الحمض النووي الفيروسي HBV DNA واحتمالية عالية للعدوى إن كان من الأم لوليدها أو من المريض لعمال القطاع الصحي

التهاب الكبد الوبائي الفيروسي (HBV DNA) Hepatitis B Viral DNA (HBV DNA)

كما هو الحال في المستضد HBeAg، يكونHBV DNA  عبارة عن واسم يدل على التكاثر الفيروسي الفعال، حيث يظهر ويختفي في المصل في نفس الوقت مثل المستضد HBeAg عند المرضى الذين يستعيدون عافيتهم من الالتهاب الكبدي الوبائي الحاد B. بينما تلعب مستويات الحمض النووي لل HBV في المصل، دوراً رئيسياً عند المرضى الذين يعانون من عدوى التهاب الكبد المزمن B، في اختيار المرشحين للعلاج المضاد للفيروسات. المرضى الذين لديهم مستويات مصل علاجي يتجاوز 200 جزء من الغرام / مل من HBV DNA يكونون أقل عرضة للاستجابة لعلاج العدوى. يتم قياس مستويات HBV DNA المصلية أيضاً بعد تقييم استجابة المريض للعلاج.

تحول الأضداد إلى مستضد التهاب الكبد B الأساسي (Anti-HBc)

Antibody to Hepatitis B Core Antigen (Anti-HBc)

بعد فترة وجيزة من اكتشاف المستضد HBsAg لأول مرة، يظهر ضد لـ HBc في المصل. كما يظهر قبل الكشف عن ضد الـ HBsAg (Anti-HBs). هناك نوعان من ضد HBc:

IgM anti-HBc  و  IgG anti-HBc.

في عدوى التهاب الكبد الوبائي الحاد (B)، يكون ال IgMضد الHBc قابل للاكتشاف. يعتبر الـ IgM anti-HBc مفيداً في تشخيص العدوى الفيروسية B الحادة، خاصة في ما يسمى بـ "فترة النافذة" أو "فترة الصمت – Window Period". فترة الصمت: هي فترة من الزمن بين اختفاء المستضد HBsAg وظهور anti-HBs. يجب قياس IgM anti-HBc عند كل مريض يُشتبه في إصابته بالتهاب الكبد B الحاد. هذا يضمن أن 10 ٪ من المرضى الذين فقدوا المستضد HBsAg، وهم في فترة الصمت، لن يتم فقدانه أثناء الاختبار المصلي. وبعد حوالي 6 - 8 أشهر، يختفي IgM anti-HBc من مصل المرضى. ومع ذلك، سيبقى اختبار ضد الـ HBC إيجابياً بشكل IgG لسنوات عديدة.

على الرغم من أن المرضى الذين يعانون من التهاب الكبد المزمن B عادةً ما يكون لديهم IgG anti-HBc موجب مع تفاقم المرض، قد يكون هناك ارتفاع في عيار IgM المضاد لـ HBc إلى مستويات قابلة للاكتشاف. وهذا يمكن أن يؤدي إلى التشويش التشخيصي، لا سيما عند المرضى الذين لم يسبق لهم المعرفة بأنهم مصابون بالتهاب الكبد (ب) المزمن، الذين يعانون من شدة المرض. في مثل هذه الحالات، قد يتم تشخيص المرضى عن طريق الخطأ على أنهم مصابون بالعدوى الفيروسية B للعدوى الفيروسية بدلاً من تفاقم التهاب الكبد المزمن.

ويكون الاتهاب الكبدي B المصلي في بعض المرضى غير ملحوظ إلا بوجود ضد HBC. ويقال إن هؤلاء المرضى معزولون لإيجابية ضد HBC لديهم. وعند مواجهة هذا الموقف، يجب الأخذ بالاعتبار ثلاثة احتمالات كتفسير لهذا النمط المصلي. وتشمل هذه الاحتمالات ما يلي:

- فترة الصمت للعدوى الفيروسية لالتهاب الكبد الحاد B

Window Period of acute hepatitis B viral infection

هناك ما يقارب 10 ٪ من المرضى الذين يعانون من العدوى الفيروسية لالتهاب الكبد الحاد B موجودين في فترة الصمت. خلال هذه الفترة الزمنية، لم يرتفع المستضد HBsAg إلى مستويات يمكن الكشف عنها. وفي هذه الحالة، يتم تأكيد تشخيص عدوى فيروس التهاب الكبد B الحاد من خلال وجود IgM anti-HBc.

- التهاب الكبد الوبائي المزمن Chronic Hepatitis B viral Infection

على الرغم من أن معظم المرضى المصابين بالتهاب الكبد الفيروسي المزمن لديهم مستويات HBsAg قابلة للكشف، بعد عدة سنوات من حدوث العدوى، قد ينخفض ​​مستوى العيار إلى مستويات غير قابلة للاكتشاف. وفي هذه الحالة، قد يكون وجود anti-HBc المعزول مؤشراً على المرض المزمن.

عندما تتم مواجهة مريض مع ضد الـ HBc المعزول، يجب تكرار الاختبار المصلي (anti-HBc، HBsAg، anti-HBs) لتأكيد وجود الخلل. وإذا استمر المريض في الحصول على نتيجة اختبار إيجابية لضد HBc، فيجب قياس IgM anti-HBc. إذا كانت النتيجة إيجابية، ينبغي تقييم المريض بالإصابة بالتهاب الكبد الفيروسي الحاد مؤخرا. وبالنسبة للمرضى الذين لديهم أعراض سريرية تتفق مع مرض التهاب الكبد المزمن، ينبغي إجراء اختبار HBV DNA لاستبعاد العدوى الفيروسية لالتهاب الكبد B المزمن.

الأضداد لسطح مولد ضد التهاب الكبد البائي B  (Anti-HBs)

Antibody to Hepatitis B Surface Antigen (Anti-HBs)

يتم الكشف عن anti-HBs بعد فترة قصيرة من اختفاء المستضد HBsAg عند المرضى الذين يستعيدون عافيتهم من التهاب الكبد الفيروسي الحاد. وتبقى مضادات الالتهاب الكبدي الوبائي قابلة للكشف لعدة سنوات قادمة. في أقلية ، ومع ذلك ، قد يكون هناك حالات قليلة لاختفاء ضد HBs. كما أن ضد HBs هو الضد الوحيد الذي ينتج أثناء التطعيم (اللقاح).

العدوى الفيروسية للالتهاب الكبدي الحاد (B)

Acute Hepatitis B Viral Infection

إن العرض السريري للعدوى بالتهاب الكبد الفيروسي B الحاد يشبه الأعراض والمسببات الفيروسية الأخرى التي تُشاهَد في التهاب الكبد. نظراً لعدم وجود خصائص مميزة في العرض السريري بشكل كافي للسماح للطبيب بفرض التمييز بين أنواع التهابات الكبد الفيروسية، يعتمد تشخيص الالتهاب الكبدي الوبائي الحاد B على نتائج الاختبارات المصلية الفيروسية.

اختبارات وظائف الكبد في التهاب الكبد الحاد الفيروسي

Liver Function Tests in Acute Hepatitis B Viral Infection

إن تشوهات اختبار وظائف الكبد لا تسمح للطبيب الممارس أن يميز التهاب الكبد الفيروسي الحاد من المسببات الأخرى لالتهاب الكبد الفيروسي كما ذكرنا. 

ولتأكيد تشخيص عدوى التهاب الكبد B الفيروسية الحادة، يجب طلب الاختبارات التالية:

- إختبار المستضد السطحي لإلتهاب الكبد (B). HBsAg.

- IgM anti-HBc.

النتائج الموجزة في المرضى المصابين بالتهاب الكبد الفيروسي الحاد تتلخص في الجدول التالي.

Phase of Acute Hepatitis B Viral Infection	Serologic Markers Present
Early Phase of Acute Hepatitis B Viral Infection	HBsAg
	IgM anti-HBc
	HBeAg
	HBV DNA
Window Period	IgM anti-HBc
Recovery	Anti-HBs
	IgG anti-HBc

ليس من الضروري طلب HBV DNA أو HBsAg. على الرغم من أنه من المرجح أن تكون هذه النتائج إيجابية، إلا أنها تضيف القليل جداً من المعلومات المفيدة في تشخيص التهاب الكبد الحاد.

العدوى الفيروسية لالتهاب الكبد المزمن B Chronic Hepatitis B Viral Infection

عندما يستمر وجود المستضد HbsAg لأكثر من 6 أشهر، عندها يتم تشخيص التهاب الكبد B المزمن. وإن أعلى خطر للإصابة بالتهاب الكبد B المزمن هو بين الأطفال الذين يولدون لأمهات يحملن فيروس التهاب الكبد B. وعموماً، يحدث الشفاء من التهاب الكبد B الحاد في > 95 ٪ من المرضى. بينما تكون نسبة 5 ٪ المتبقية من المرضى مؤشراً يعبر عن استمرار التهاب الكبد B إما كإلتهاب كبد مزمن (متماثل - Replicative) أو كحامل مزمن (غير متماثل – Nonreplicative) عديم الأعراض.

اختبارات وظائف الكبد في الالتهاب الكبدي الوبائي المزمن

Liver Function Tests in Chronic Hepatitis B Viral Infection

قد تكون مستويات إنزيم الترانس أميناز طبيعية تماماً عند مرضى التهاب الكبد B المزمن، خاصةً عند الأشخاص الحاملين لالتهاب الكبد B أو الذين يعانون من تليف الكبد المعوَّض بشكل جيد. ومع ذلك، معظم المرضى لديهم ارتفاعات خفيفة إلى معتدلة بمستويات ALT بشكل عام، حيث تكون أعلى من مستويات AST. وفي بعض الأحيان، ترتفع مستويات الترانس أميناز بشكل ملحوظ مع تفاقم المرض (الارتفاع في ALT يصل إلى 50 ضعف الحد الأعلى من المعدل الطبيعي). في حين أن الارتفاع الملحوظ في مستويات الترانس أميناز قد يعكس فقط تفاقم الإصابة بالتهاب الكبد الفيروسي المزمن B، ويجب على الطبيب التأكد من عدم وجود أسباب أخرى للإصابة بالتهاب الكبد.

ينبغي النظر في تطور مرض الكبد إلى تليُّف للكبد عندما يتطور نقص الكريات البيض Leukopenia أو نقص الصفيحات Thrombocytopenia، مما يشير إلى وجود تضخم الطحال Splenomegaly. أيضاً، يجب أن يثير اكتشاف نقص ألبومين الدم أو اختبار PT الطويل القلق نفسه.

بناء تشخيص التهاب الكبد الوبائي المزمن

Establishing the Diagnosis of Chronic Hepatitis B Viral Infection

يتم تشخيص التهاب الكبد المزمن B عند استمرار وجود المستضد HBsAg في مصل الدم بعد 6 أشهر. عادة ما يكون IgG anti-HBc موجوداً في هذا النوع من المرضى. حالما يتم تشخيص عدوى التهاب الكبد B المزمن، يجب على الطبيب إجراء المزيد من الاختبارات وخاصةً اختبار HBV DNA و HBsAg، حيث يفيد هذا الاختبار في التمييز بين العدوى المتماثلة و غير المتماثلة. بالإضافة إلى ذلك، فإن المعلومات التي تم الحصول عليها من هذه الاختبارات المصلية الإضافية ستساعد في توجيه القرارات المتعلقة بالحاجة إلى العلاج المضاد للفيروسات.

قد تختلف أنماط المصلية من التهاب الكبد B المزمن اعتماداً على الحالة المتكررة (المتماثلة Replicative) للفيروس. فمن المحتمل أن يكون النسخ الفيروسي الفعال نشطًا إذا تم الحصول على النمط التالي في الاختبار المصلي:

(-) Anti-HBs	(+) HBV DNA
(-) Anti-HBe	(+) HBeAg
(+) Anti-HBc	(+) HBsAg

ويتم تعريف حالة الناقل المزمن (غير المتكرر – غير المتماثل Non-Replicative) استناداً إلى النمط التالي:

(-) HBV DNA	(-) Anti-HBs
(-) HBeAg	(+) Anti-HBe
(+) HBsAg	(+) Anti-HBc

مقارنة بين الحالة المتماثلة Replicative وغير المتماثلة Non-Replicative للاتهاب الكبد المزمن: 

	HBsAg	HBV DNA	HBeAg	Anti-HBs	Anti-HBc	Anti-HBe
Replicative State	(+)	(+)	(+)	(-)	(+)	(-)
Nonreplicative State	(+)	(-)	(-)	(-)	(+)	(+)

العديد من المرضى يتنقلون ذهابا وإيابا بين الحالات المتماثلة وغير المتماثلة من التهابات الكبد. ومع تحويل الحالة التكاثرية إلى الحالة غير التكاثرية، يتم فقدان المستضد HBeAg ويتم الكشف عن ضد لـ HBe في المصل. وهناك احتمال بنسبة 10٪ إلى 15٪ للتحول العفوي (التلقائي) من الحالة التكاثرية إلى الحالة غير التكاثرية لعدوى التهاب الكبد B كل عام.

الحل لإلتهاب الكبد المزمن B

Resolution of chronic Hepatitis B

وبشكل عام، فإن المريض الذي أصيب بالتهاب الكبد (ب) المزمن يواجه مرضه مدى الحياة. بينما المرضى الذين لم يتم علاجهم، فإن متوسط معدل التطور التلقائي للمناعة، الذي يتميز باختفاء المستضد HBsAg وظهور مضادات الالتهابات HBs، يتراوح بين 1 ٪ إلى 2 ٪ سنويا.

كما يتم تحصين المرضى الذين يتلقون اللقاح ضد التهاب الكبد B بالمستضد HBsAg. حيث يكون شكل الضد إيجابي فقط بالنسبة لضد HBS.

References;

Badur S and Akgun A, "Diagnosis of Hepatitis B Infections of Treatment".

Dufour DR, Lott JA, NoltecFS, et al, "Diagnosis and Monitoring of Hepatic Injury. II Recommendations for Use of Laboratory Tests in Screening, Diagnosis, and Monitoring."

Lin KW and Kirchner JT, "Hepatitis B." Lok AS "Hepatitis B infection: Pathogenesis and Management."

Lok AS, Heathcote EJ, and Hoofnagle JH, "Management of Hepatitis B: 2000 - summary of a workshop."